2 × Пфу ПТР аралашмасы

A-1 шаблону

■ Калыпта протеин кошулмалары же Taq ингибиторлору бар, ж.

■ Калыптын денатурациясы толук эмес - Денатурация температурасын тийиштүү түрдө жогорулатуу жана денатурация убактысын узартуу.

■ Калыптын деградациясы ——Калыпты кайра даярдаңыз.

A-2 праймер

■ Праймерлердин сапаты начар --— Праймерди кайра синтездөө.

■ Праймердин бузулушу - Консервациялоо үчүн жогорку концентрациядагы праймерлерди кичине көлөмгө бөлүңүз. Бир нече жолу тоңдуруудан жана эритүүдөн же узак мөөнөттүү 4 ° C криоконсервациядан алыс болуңуз.

■ Праймердин туура эмес дизайны (мис. Праймердин узундугу жетишсиз, праймердин ортосунда димер пайда болгон ж.б.)

A-3 Mg²⁺концентрация

■ Mg²⁺ концентрациясы өтө төмөн - Мнгди туура көбөйтүү²⁺ концентрация: Mg оптималдаштыруу²⁺ оптималдуу Mg аныктоо үчүн 0,5 мм аралыгы менен 1 мМден 3 ммге чейинки реакциялар сериясы аркылуу концентрациялоо²⁺ ар бир шаблон жана праймер үчүн концентрация.

A-4 Күйүү температурасы

■ Тартуунун жогорку температурасы праймер менен шаблондун байланыштырылышына таасир этет. —— Күйүүчү температураны төмөндөтүңүз жана 2 ° C градиенти менен абалды оптималдаштырыңыз.

A-5 Узартуу убактысы

■ Кыска узартуу убактысы —— Узартуу убактысын жогорулатуу.

Феноменалар: Терс үлгүлөр ошондой эле максаттуу ырааттуулук тилкелерин көрсөтөт.

А-1 ПТРдин булганышы

■ Максаттуу ырааттуулуктун же күчөтүүчү продуктулардын кайчылаш булганышы - Терс үлгүдөгү максаттуу ырааттуулукту камтыган үлгүнү пипеткага түшүрбөө же центрифуга түтүгүнөн төгүп албоо. Реактивдер же жабдуулар болгон нуклеин кислоталарын жок кылуу үчүн автоклавда болушу керек жана булгануунун бар -жогун терс контролдук эксперименттер аркылуу аныктоо керек.

■ Реагенттердин булганышы - Реагенттерди бөлүп, төмөнкү температурада сактаңыз.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ концентрациясы өтө төмөн - Мнгди туура көбөйтүү²⁺ концентрация: Mg оптималдаштыруу²⁺ оптималдуу Mg аныктоо үчүн 0,5 мм аралыгы менен 1 мМден 3 ммге чейинки реакциялар сериясы аркылуу концентрациялоо²⁺ ар бир шаблон жана праймер үчүн концентрация.

■ Туура эмес праймер дизайны жана максаттуу ырааттуулук максаттуу эмес ырааттуулук менен гомологияга ээ. ——Кайта конструкциялоочу праймерлер.

Феноменалар: ПТРдин күчөтүү тилкелери күтүлгөн өлчөмгө карама-каршы келет, же чоң, же кичине, же кээде спецификалык күчөтүү тилкелери да, спецификалык эмес күчөтүү тилкелери да пайда болот.

A-1 Primer

■ Праймердин өзгөчөлүгү начар

——Кайта конструкциялоочу праймер.

■ Праймердин концентрациясы өтө жогору —— денатурациянын температурасын туура жогорулатуу жана денатурация убактысын узартуу.

A-2 Mg²⁺ концентрация

■ Mg²⁺ концентрация өтө жогору —— Mg2+ концентрациясын туура азайтуу: Mg оптималдаштыруу²⁺ оптималдуу Mg аныктоо үчүн 0,5 мм аралыгы менен 1 мМден 3 ммге чейинки реакциялар сериясы аркылуу концентрациялоо²⁺ ар бир шаблон жана праймер үчүн концентрация.

А-3 Термостабилдүү полимераза

■ Ферменттин ашыкча өлчөмү ——Ферменттин көлөмүн туура 0,5 У аралыкта азайтуу.

A-4 Күйүү температурасы

■ Күйгүзүү температурасы өтө төмөн —- Тиешелүү түрдө күйгүзүү температурасын жогорулатыңыз же эки баскычтуу күйүү ыкмасын колдонуңуз

А-5 ПТР циклдери

■ ПТР циклдеринин өтө көп болушу - ПТР циклдеринин санын азайтуу.

A-1 Primer—— начар специфика —— праймерди кайра долбоорлоо, анын өзгөчөлүгүн жогорулатуу үчүн праймердин ордун жана узундугун өзгөртүү; же Киргизилген ПТРди жасаңыз.

A-2 үлгүсү ДНК

—–Калып таза эмес - шаблонду тазалаңыз же ДНКны тазалоочу комплекттер менен бөлүп алыңыз.

A-3 Mg²⁺ концентрация

——Мг²⁺ концентрация өтө жогору —— Мгди туура азайтуу²⁺ концентрация: Mg оптималдаштыруу²⁺ оптималдуу Mg аныктоо үчүн 0,5 мм аралыгы менен 1 мМден 3 ммге чейинки реакциялар сериясы аркылуу концентрациялоо²⁺ ар бир шаблон жана праймер үчүн концентрация.

A-4 dNTP

——ДНТПлардын концентрациясы өтө жогору —ДНТПнын концентрациясын тийиштүү түрдө азайтыңыз

A-5 Күйүү температурасы

——Күйүү температурасы өтө төмөн ——Жуууу температурасын тийиштүү түрдө жогорулатыңыз

A-6 циклдери

——Ото көп цикл ——Циклдин санын оптималдаштыруу

Биринчи кадам - ​​ылайыктуу полимеразаны тандоо. Кадимки Taq полимеразасы 3'-5 'экзонуклеаз активдүүлүгүнүн жоктугунан текшере албайт, жана дал келбөөчүлүк фрагменттердин кеңейтүү эффективдүүлүгүн төмөндөтөт. Ошондуктан, кадимки Taq полимеразасы 5 кбдан чоңураак максаттуу фрагменттерди эффективдүү түрдө күчөтө албайт. Атайын модификациясы же башка жогорку ишенимдүүлүк полимеразасы бар так полимеразасы узартуунун эффективдүүлүгүн жогорулатуу жана узун фрагменттин күчөтүлүшүнүн муктаждыктарын канааттандыруу үчүн тандалышы керек. Мындан тышкары, узун фрагменттерди күчөтүү праймер дизайнын, денатурация убактысын, узартуу убактысын, буфердик рН ж. Калыптын бузулушуна жол бербөө үчүн, 94 ° С денатурация убактысы циклде 30 сек же андан азга чейин кыскартылышы керек, ал эми күчөтүүдөн мурун температураны 94 ° Сге чейин көтөрүү убактысы 1 мүнөттөн аз болушу керек. Мындан тышкары, узартуу температурасын болжол менен 68 ° Сге орнотуу жана узартуу убактысын 1 кб/мин ылдамдыгына ылайык долбоорлоо узун фрагменттердин эффективдүү күчөтүлүшүн камсыздай алат.

ПТРди күчөтүүнүн каталык ылдамдыгы ар кандай ДНК полимеразаларын жогорку ишенимдүүлүк менен азайтууга болот. Буга чейин табылган бардык Taq ДНК полимеразаларынын ичинен Pfu ферментинин эң төмөнкү ката ылдамдыгы жана эң жогорку ишенимдүүлүгү бар (тиркелген таблицаны караңыз). Фермент тандоодон тышкары, изилдөөчүлөр реакция шарттарын оптималдаштыруу аркылуу ПТР мутация ылдамдыгын андан ары төмөндөтө алышат, анын ичинде буфердик курамды оптималдаштыруу, термостабилдүү полимеразанын концентрациясы жана ПТР циклинин санын оптималдаштыруу.