FastKing RT Kit (gDNase менен)

А-1 РНК деградацияланган

—— Жогорку сапаттагы РНКны булганбастан тазалаңыз. РНК алынуучу материал РНКнын деградациясын болтурбоо үчүн мүмкүн болушунча жаңы болушу керек. RT реакциясына чейин денатуратталган гелдеги РНК бүтүндүгүн талдаңыз. РНК экстракциясынан кийин аны 100% формамидде сактоо керек. Эгерде RNase ингибитору колдонулса, анда ысытуу температурасы <45 ° C, рН 8.0дан аз болушу керек, антпесе ингибитор RNase байланышкан бардык байланыштарды коё берет. Мындан тышкары, RNase ингибиторун ≥ 0,8 мм DTT камтыган эритмелерге кошуу керек.

А-2 РНКнын курамында тескери транскрипция реакцияларынын ингибиторлору бар

——Кайтарым транскрипциянын ингибиторлоруна SDS, EDTA, глицерин, натрий пирофосфаты, спермидин, формамид, гуанидин тузу ж. Ингибиторлорду жок кылуу үчүн РНКнын жаан -чачынын 70% этанол менен жууңуз.

A-3 cDNAнын биринчи тилкесин синтездөө үчүн колдонулган праймерлерди жетишсиз күйгүзүү

—— Тартуу температурасы экспериментте колдонулган праймерлерге ылайыктуу экенин аныктаңыз. Кокус гексамерлер үчүн реакциянын температурасына жеткенге чейин температураны 25 ° Сде 10 мүнөт кармоо сунушталат. Генге тиешелүү праймердер (GSP) үчүн башка GSPти колдонуп көрүңүз же олиго (dT) же кокустук гексамерге өтүңүз.

A-4 РНКнын кичине өлчөмү

—— РНКнын көлөмүн көбөйтүү. 50 нгден аз болгон РНК үлгүлөрү үчүн 0,1 мкгдан 0,5 мкг ацетил BSA биринчи жип cDNA синтезинде колдонулушу мүмкүн.

A-5 Максаттуу ырааттуулук анализделген ткандарда көрсөтүлгөн эмес.

——Башка ткандарды сынап көрүңүз.

А-6 ПТР реакциясы ишке ашпайт

—— Эки баскычтуу RT-ПТР үчүн ПТР кадамындагы cDNA шаблону реакциянын көлөмүнүн 1/5 бөлүгүнөн ашпашы керек.

A-1 Праймердерди жана шаблондорду спецификалык эмес күйгүзүү

Праймерлердин 3'-учунда 2-3 dG же dC болбошу керек. Кокус праймердин же олигонун ордуна биринчи жипти синтездөөдө Генге тиешелүү праймердерди колдонуңуз (dT). Алгачкы бир нече циклде жогорку күйгүзүү температурасын колдонуңуз, андан кийин төмөн температура. Реакциянын өзгөчөлүгүн жакшыртуу үчүн ПТР үчүн ысык башталуучу Taq ДНК полимеразасын колдонуңуз.

А-2 Генге тиешелүү праймерлердин начар дизайны

Принтердин дизайнын күчөтүү үчүн ушул эле принциптерди карманыңыз.

А-3 РНК геномдук ДНК менен булганган

—— РНКны ПТР-класстагы DNase I. менен дарылаңыз, ДНКнын булгануусун аныктоо үчүн тескери транскрипциясы жок башкаруу реакциясын орнотуңуз.

A-4 Primer dimer түзүү

—- 3 'аягында кошумча тизмектери жок праймердерди долбоорлоо.

A-5 Өтө бийик Mg²⁺ концентрация

Mg оптималдаштыруу²⁺ ар бир шаблон жана праймер айкалышы үчүн концентрация

А-6 Чет элдик ДНК менен булганган

——Аэрозолго туруктуу учтарды жана UDG ферменттерин колдонуңуз.

A-1 Биринчи жип продуктунун мазмуну өтө жогору

—— Кадимки ПТР реакция кадамында биринчи жип продуктунун көлөмүн азайтыңыз.

А-2 ПТР реакциясында өтө жогорку праймер суммасы

—— Праймерди киргизүүнү азайтыңыз.

A-3 Өтө көп цикл

—— ПТР реакция шарттарын оптималдаштыруу жана ПТР циклинин санын азайтуу.

A-4 Күйүү температурасы өтө төмөн

—- Спецификалык эмес баштоону жана узартууну болтурбоо үчүн күйгүзүү температурасын жогорулатыңыз.

A-5 ДНКнын DNase деградациясы менен пайда болгон олигонуклеотид фрагменттеринин спецификалык эмес күчөтүлүшү-ДНКнын булгануусун алдын алуу үчүн жогорку сапаттагы РНКны бөлүп алуу.

RT-ПТР-бул РНКны cDNAга кайтаруу, андан кийин тескери транскрипцияланган cDNAны максаттуу фрагментти күчөтүү үчүн ПТР реакциясы үчүн шаблон катары колдонуу. Эксперименттин конкреттүү шарттарына ылайык кокустук праймерлерди, Oligo dTди жана генге тиешелүү праймердерди тандаңыз. Жогорудагы бардык праймердерди чач эшиги түзүлүшү жок кыска эукариоттук клетка mRNA үчүн колдонсо болот.

Кокустук праймер: Узун РНКга чачтын структурасы, ошондой эле РНКнын бардык түрлөрү, мРНК, тРНК ж.

Oligo dT: PolyA калдыктары бар РНК үчүн ылайыктуу (прокариоттук РНК, эукариоттук Oligo dT rRNA жана tRNAда PolyA куйруктары жок). Oligo dT PolyA куйругунан байлангандыктан, РНК үлгүлөрүнүн сапаты жогору болушу талап кылынат, ал тургай кичине деградация cDNA синтезинин толук көлөмүн азайтат.

Генге тиешелүү праймер: Максаттуу ырааттуулук белгилүү болгон жагдайларга ылайыктуу шаблондордун ырааттуулугуна кошумча.

Эки жолу бар:

1. Ички шилтеме ыкмасы: теория боюнча, cDNA - ар кандай узундуктагы ДНК фрагменттери, андыктан электрофорездин жыйынтыгы мазак болот. Эгерде РНКнын көптүгү аз болсо, анда эч кандай продукт электрофорезде көрсөтүлбөйт, бирок бул ПТР менен эч кандай продукт күчөтүлбөйт дегенди билдирбейт. Жалпысынан алганда, ички шилтеме cDNA аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн. Ички шилтеме жыйынтыктары бар болсо, cDNA сапаты негизинен кепилдикке алынышы мүмкүн (кээ бир учурларда, эгерде максаттуу ген фрагмент өтө узун болсо, өзгөчө учурлар болушу мүмкүн).

2. Эгерде бул шаблон аркылуу күчөтүлгөн белгилүү бир ген бар болсо, аны бул гендин праймердери аркылуу текшерүүгө болот. Ички шилтемени күчөтүү cDNA менен эч кандай маселе жок дегенди билдирбейт. Ички шилтеме cDNAда көп болгондуктан, аны көбөйтүү оңой. Эгерде cDNA ар кандай себептерден улам жарым -жартылай бузулса, ыктымалдуулуктун көз карашынан алганда, максаттуу гендердин аз болушу ПТР жыйынтыктарына чоң таасирин тийгизет. Ички шилтеме дагы деле көп болсо да, күчөтүү таасир этпейт.

РНКнын жарым -жартылай бузулушу. РНКнын бүтүндүгүн аныктап, тазалаңыз

Ар кандай түрдөгү РНКнын мазмуну ар түрдүү болушу мүмкүн, бирок жалпысынан алганда, алынган жалпы РНКда гель электрофорезинде эки ачык 28S жана 18S диапазону болууга тийиш жана мурунку тилкенин жарыктыгы экинчисинен эки эсе жогору болушу керек. 5S диапазону РНКнын деградацияланганын көрсөтөт жана анын жарыктыгы деградация даражасына пропорционалдуу. Ички шилтемени ийгиликтүү күчөтүү РНК менен эч кандай көйгөй жок дегенди билдирбейт, анткени ички шилтеме көп болгондуктан, РНКны деградация катуу болбосо эле күчөтсө болот. OD₂₆₀/OD₂₈₀Спектрофотометр менен өлчөнүүчү таза РНКнын катышы 1,9 жана 2,1 ортосунда болушу керек. РНКдагы бир аз протеин кошулмалары катышты азайтат. Качан гана мааниси өтө төмөн болбосо, RT таасир этпейт. RT үчүн эң маанилүүсү РНКнын бүтүндүгү.

Ички шилтеме генинин узартылышы RT ийгиликтүү болгонун гана көрсөтө алат, бирок бул сөзсүз түрдө cDNA тилкесинин сапатына байланыштуу эмес. Ички шилтеме фрагменттери негизинен кичине жана экспрессивдүү болгондуктан, тескери транскрипцияда ийгиликтүү болуу оңой. Бирок, максаттуу гендин өлчөмү жана экспресси генден генге чейин өзгөрөт. CDNA сапатын ички шилтеме менен гана баалоого болбойт, айрыкча 2 кбдан ашкан максаттуу фрагменттер үчүн.

Кээ бир үлгүлөр татаал орто структураларга ээ, же бай GC мазмунуна ээ, же аз молчулук менен баалуу. Мындай учурларда, максаттуу фрагменттин өлчөмүнө жана үлгүгө ылайыктуу түрдө арткы транскриптазаны тандоо керек. Жогорку GC мазмуну жана татаал орто структурасы бар РНК шаблондору үчүн, экинчи структураны төмөнкү температурада же жалпы тескери транскриптазасы менен ачуу кыйын. Бул шаблондор үчүн Quant Reverse Transcriptase тандап алса болот, анткени анын тескери транскрипциясынын аткарылышы M-MLV сериясындагы тескери транскриптазага караганда жакшыраак, бул ар кандай РНК шаблондорун эффективдүү түрдө транскрипциялоого жана РНКны cDNAнын биринчи тилкесине максималдуу түрдө транскрипциялоого мүмкүндүк берет. Жалпы тескери транскриптазды колдонууда 20 мкл системасы 1 мкг жалпы РНКны эффективдүү кайтара алат. Сураныч, комплектинин максималдуу RT кубаттуулугуна көңүл буруңуз. Эгерде шаблон ашыкча кошулса, тескери транскрипция РНКны көп молчулукка жактырат. Ошондуктан, системанын максималдуу кубаттуулугун ашпаган жакшы.

A-1 РНК катуу деградацияланганын жана RT ийгиликтүү болгонун аныктаңыз

Жалпысынан алганда, ички шилтеме күчөтүүсүнүн ийгиликсиздигинин себеби көп учурда РНКнын олуттуу деградациясынан келип чыгат. Дагы бир мүмкүн болгон себеп - бул транскрипциянын иштебей калышы. Ички шилтеме cDNA бир талынын сапатын баалоо үчүн стандарт катары колдонулушу мүмкүн эмес, бирок эгерде РНКнын сапатында эч кандай көйгөй болбосо, тескери транскрипциянын ийгиликтүү болгонун баалоо үчүн стандарт катары колдонсо болот. Тескери транскрипция процессиндеги эң маанилүү нерсе - реакциянын эффективдүүлүгүн жогорулатуу үчүн туруктуу температураны жана туруктуу реакция системасын сактоо.

A-2 Ички шилтеме гендерин күчөтүү үчүн праймердердин ишенимдүү экендигин жана ПТРде колдонулган реагенттер менен кандайдыр бир көйгөйлөр бар-жогун аныктаңыз.

Салыштырмалуу сан үчүн РНКны тескери транскрипцияга чейин саноо керек, бул дагы көптөгөн тескери транскрипция топтомдорунда талап кылынат, мисалы, РНКнын киришин 1 мкг катары санайт. Тескери транскрипцияланган cDNA РНК, олиго dT, фермент, dNTP, ал тургай кичине ДНК калдыктарын камтыган аралаш чечим болгондуктан, четтөө пайда болот, андыктан cDNAнын так санын аныктоо мүмкүн эмес. Ошондуктан, РНКнын санын аныктоо зарыл. Кайтарым транскрипциянын эффективдүүлүгү ар кандай үлгүлөрдүн ортосунда бирдей экенин эске алганда, алынган cDNAнын көлөмү бирдей болушу керек жана сандык анализ жалпы РНКнын бирдей өлчөмүндө ар кандай гендердин экспрессия деңгээлин салыштырууну көрсөтө алат. Салыштырмалуу флуоресценттик сандык ПТРди аткарууда, тескери транскрипциядан кийин сандык cDNA талап кылынбашы мүмкүн, анткени ички шилтеме ген шилтеме катары иштей алат.

Бул негизинен гендерге байланыштуу жана узун фрагменттин тескери транскрипциясы көпчүлүк гендер үчүн мүмкүн эмес. Биринчиден, тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү ПТРге караганда алда канча төмөн. Экинчиден, ГКга бай аймак жана көптөгөн гендердин экинчи структурасы тескери транскрипцияны жана ПТРди чектейт. Акыр -аягы, ПТРдин тактыгына жана күчөтүлүшүнө бир эле учурда кепилдик берүү кыйын. Кайтарым транскрипциялоо процессинде, эч ким, айрыкча oligo dT колдонуп, аз көчүрүлүүчү гендер үчүн узун фрагментти алууга кепилдик бере албайт. ГК көбүрөөк болгон 5 'УТРга келсек, андан да кыйын. Ошондуктан, туш келди праймер менен стенограмманы артка кайтаруу, максаттуу фрагменттеги табигый бөлүнүү жерлерин табуу, сегменттер боюнча күчөтүү жана андан кийин чектөө сиңирүүнү жана байлоону аткаруу акылга сыярлык ыкма. Жалпысынан алганда, 2 кбдан чоң фрагменттерди түздөн -түз күчөтүү кыйын, бирок аны алуу дайыма эле мүмкүн боло бербейт: 1. Биринчиден, РНК/мРНКнын бүтүндүгүн кепилдикке алыңыз жана TRIZOL экстракциясы артыкчылыктуу. 2.M-MLV RT-ПТР комплект түздөн-түз колдонулушу мүмкүн. Тууралоо убактысын узартыңыз жана күчөтүү процессинде циклдин санын туура көбөйтүңүз. Же болбосо, кыналган ПТРди колдонсо болот, же фрагменттерди узартууга жардам бере турган кадимки ПТРди күчөтүүдөн мурун денатурация жана узартуу убактысы менен бир же эки реакцияны ишке ашырса болот. Полимеразанын ишенимдүүлүгүнө көңүл буруңуз. 3. Long Taq идеалдуу жыйынтыктарды алуу үчүн ПТРда колдонулушу мүмкүн. 4. Белокту билдирүү үчүн жогорку тактык полимеразасын колдонуу керек.

TIANGEN сунуштаган тескери транскриптазанын эки түрү бар: Quant/King RTase жана TIANScript M-MLV. Алардын ортосундагы негизги айырма шаблондордун кириш көлөмүндө. Quant-уникалдуу арткы транскриптаз, ал Moloney murine leukemia вирусунан алынган көп колдонулган M-MLVден айырмаланат. Quant-бул жогорку эффективдүү арткы транскриптаза, Escherichia coli инженериясы тарабынан рекомбинанттык түрдө билдирилген. Quant жогорку тескери транскрипциялык активдүүлүгү жана жогорку түшүмдүүлүгү менен 50 нг-2 мкг РНКны күчөтүүгө ылайыктуу. Кадимки MMLV же AMV менен салыштырганда, Quantтин эң чоң өзгөчөлүгү - бул РНК шаблондору менен абдан күчтүү жакындыкка ээ жана жогорку температура денатурациясы жок транскрипцияланган татаал калыптарды артка кайтара алат. Жогорку GC мазмуну бар шаблондор үчүн тескери натыйжалуулук жогору. Бирок, бул тескери транскриптазада cNNA продуктунун узундугуна таасир эте турган RNase H активдүүлүгү бар (<4.5 кб шаблондорго ылайыктуу). Кадимки тескери транскрипция үчүн TIANScript MMLV тескери транскриптазасы сунушталат. Бул RTase узак (> 5 kb) cDNA синтезине ылайыктуу болгон абдан алсыз RNase H активдүүлүгү менен өзгөртүлгөн фермент.

Бир кадам артка транскрипциялоо жана ПТРди күчөтүү ошол эле түтүктө cDNA синтези менен күчөтүүнүн ортосундагы түтүк капкагын ачпастан бүтөт, бул булганууну азайтууга жардам берет. Бардык алынган cDNA үлгүлөрү күчөтүү үчүн колдонулгандыктан, сезгичтиги жогору, жалпы РНКнын 0.01 пг аз. Бир баскычтуу ийгиликтүү RTPCR үчүн, генге тиешелүү праймердер көбүнчө cDNA синтезин баштоо үчүн колдонулат. Эки этаптуу ыкма, тактап айтканда тескери транскрипция жана ПТРди күчөтүү эки этапта жүргүзүлөт. Биринчиден, тескери транскрипция cDNA алуу үчүн РНК шаблонунан жүргүзүлөт жана алынган cDNA бир же бир нече башка ПТР реакцияларына дуушар болот. Эки этаптуу ыкма cDNAнын биринчи тизмегинин синтезин жетектөө үчүн олиго (dT) же туш келди праймерлерди колдонуп, белгилүү бир үлгүдөгү бардык mRNA маалыматын артка кайтара алат.