TIANSeq DNA Quantification Kit (Illumina)

Азыркы учурда, өндүрүмдүүлүгү жогору болгон секвенирлөө технологиясы негизинен кийинки муундагы секвенирлөө технологиясына негизделген. Кийинки муундагы секвенирлөө технологиясынын окуу узактыгы чектелгендиктен, биз толук узундуктун ырааттуулугун чакан фрагменттик китепканаларга бөлүүбүз керек. Ар кандай секвенирлөө эксперименттеринин керектөөлөрүнө ылайык, биз көбүнчө бир учтуу же эки учтуу тизүүнү тандайбыз. Учурда кийинки муундагы секвенция китепканасынын ДНК фрагменттери жалпысынан 200-800 bp диапазонунда таркатылган.

а) ДНКнын сапаты начар жана ингибиторлору бар. Фермент активдүүлүгүн ингибирлөө үчүн жогорку сапаттагы ДНК үлгүлөрүн колдонуңуз.

б) ДНК китепканасын куруу үчүн ПТРсиз ыкманы колдонууда ДНК үлгүсүнүн саны жетишсиз. Бөлүнгөн ДНКнын кириши 50 нгден ашканда, ПТРсиз жумуш процесси китепкананын курулуш процессинде тандалма түрдө жүргүзүлүшү мүмкүн. Эгерде китепкананын көчүрмөлөрүнүн саны түздөн -түз иретке келтирилбесе, адаптер лигировкасынан кийин ДНК китепканасы ПТР менен көбөйтүлүшү мүмкүн.

в) РНКнын булганышы ДНКнын так эмес санынын так эместигине алып келет РНКнын булгануусу геномдук ДНКны тазалоо процессинде болушу мүмкүн, бул ДНКнын так эмес санына жана китепкана куруу учурунда ДНКнын жетишсиз жүктөлүшүнө алып келиши мүмкүн. РНКны RNase менен дарылоо аркылуу алып салса болот.

A-1

а) Чакан фрагменттер (60 bp-120 bp) пайда болот Чакан фрагменттер адатта адаптер фрагменттери же адаптерлер тарабынан түзүлгөн димерлер. Agencourt AMPure XP магниттик мончоктору менен тазалоо бул адаптердин фрагменттерин эффективдүү түрдө жок кылып, ырааттуулук сапатын камсыздай алат.

б) ПТРди күчөтүүдөн кийин китепканада чоң фрагменттер пайда болот. Эгерде адаптер лигировкасынан кийин ДНК фрагмент 120 bpден ашык көбөйсө, анда ПТРди ашыкча күчөтүүнүн анормалдуу фрагментинин күчөшүнөн келип чыгышы мүмкүн. ПТР циклинин санын азайтуу кырдаалды алдын алат.

в) адаптер байлоодон кийин китепкананын ДНК фрагменттеринин анормалдуу өлчөмү Бул комплекттеги адаптердин узундугу 60 барр. Фрагменттин эки учу адаптерлерге байланганда, узундугу 120 баррелге гана көбөйөт. Бул комплект менен камсыздалгандан башка адаптер колдонулганда, адаптердин узундугу сыяктуу тиешелүү маалыматты берүү үчүн жеткирүүчүгө кайрылыңыз. Сураныч, эксперименттин иштөө процесси жана операциясы колдонмодо сүрөттөлгөн кадамдарды аткарышын камсыз кылыңыз.

г) Адаптер лигировкасынан мурун анормалдуу ДНК фрагментинин өлчөмү Бул көйгөйдүн себеби ДНКнын фрагментация учурунда туура эмес реакция шарттарынан келип чыгышы мүмкүн. ДНКнын кириши үчүн ар кандай реакция убактысы колдонулушу керек. Эгерде ДНКнын кириши 10 нгден ашык болсо, анда оптимизациянын башталыш убактысы катары 12 мүнөт реакция убактысын тандап алууну сунуштайбыз жана бул убакта өндүрүлгөн фрагменттин көлөмү негизинен 300-500 bp диапазонунда болот. Колдонуучулар керектүү өлчөмдөгү ДНК фрагменттерин оптималдаштыруу үчүн өз талаптарына ылайык ДНК фрагменттеринин узундугун 2-4 мүнөткө көбөйтө же азайта алышат.

A-2

а) Бөлүнүү убактысы оптималдаштырылган эмес, эгерде фрагменттелген ДНК өтө кичине же өтө чоң болсо, реакция убактысын аныктоо үчүн инструкцияда берилген Бөлүнүү убактысын тандоо боюнча нускамаларды караңыз жана бул убакыт чекитин көзөмөл катары колдонуңуз. реакция системасы 3 мүнөт узартуу же кыскартуу үчүн, фрагментация убактысын тагыраак тууралоо үчүн.

A-3

Фрагментациядан кийин ДНКнын анормалдуу өлчөмдөгү бөлүштүрүлүшү

а) Бөлүнүү реагентинин туура эмес эритүү ыкмасы, же реагент ээригенден кийин толук аралашпайт. 5 × Fragmentation Enzyme Mix реагентин муз үстүндө эритүү. Эригенден кийин трубанын түбүн акырын чайкоо менен реагентти бирдей аралаштырыңыз. Реагентти айландырбаңыз!

б) ДНКнын кириш үлгүсүндө EDTA же башка булгоочу заттар бар ДНК тазалоо кадамында туз иондорунун жана хелаттоочу заттардын жок болушу эксперименттин ийгилиги үчүн өзгөчө маанилүү. Эгерде ДНК 1 × ТЭде ээритилсе, фрагментациялоо үчүн инструкцияда берилген ыкманы колдонуңуз. Эгерде эритмеде EDTA концентрациясы белгисиз болсо, анда ДНКны тазалоо жана кийинки реакция үчүн аны иондоштурулган сууда эритүү сунушталат.

в) Туура эмес баштапкы ДНК өлчөмү Бөлүнгөн ДНКнын өлчөмү ДНКнын киришинин өлчөмү менен тыгыз байланышта. Бөлүнүү терапиясынан мурун, реакция системасындагы ДНКнын так санын аныктоо үчүн Qubit, Picogreen жана башка ыкмаларды колдонуу менен ДНКнын так санын аныктоо өтө маанилүү.

 г) Реакция системасын даярдоо көрсөтмөгө ылайык келбейт. Бөлүнгөн реакция системасын даярдоо муз үстүндө көрсөтмөлөргө ылайык так аткарылышы керек. Эң жакшы эффектти камсыз кылуу үчүн, реакциянын бардык компоненттери музга коюлушу керек жана реакция системасын даярдоо толук муздагандан кийин жүргүзүлүшү керек. Даярдоо аяктагандан кийин, жакшылап аралаштыруу үчүн чайкаңыз же пипеткадан өтүңүз. Айланбаңыз!

1. Туура эмес аралаштыруу ыкмасы (бурулуш, зордук -зомбулук ж. Б.) Китепкананын фрагменттеринин анормалдуу таралышына алып келет (кийинки сүрөттө көрсөтүлгөндөй), ошону менен китепкананын сапатына таасирин тийгизет. Андыктан, Fragmentation Mix реакция эритмесин даярдап жатканда, акырын аралаштыруу үчүн өйдө -ылдый пипеткадан өткөрүңүз, же бармактын учу менен бир калыпта аралаштырыңыз. Айланмага аралашпоо үчүн этият болуңуз.

2. Китепкана куруу үчүн жогорку тазалыктагы ДНК колдонулушу керек

■ ДНКнын бүтүндүгү: электрофорез тобу 30 кб ашык, калдыктары жок

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ДНКнын өлчөмү так болушу керек ДНКны саноо үчүн Nanodrop эмес, Qubit жана PicoGreen ыкмаларын колдонуу сунушталат.

4. ДНКнын эритмесиндеги EDTAнын мазмунун аныктоо керек EDTA фрагментация реакциясына чоң таасирин тийгизет. EDTAнын мазмуну жогору болсо, ДНК тазалоо кийинки тестке чейин жүргүзүлүшү керек.

5. Бөлүнүү реакциясынын эритмеси музда даярдалышы керек. Бөлүнүү процесси реакциянын температурасына жана убактысына (өзгөчө күчөткүчтү кошкондон кийин) сезимтал. Реакция убактысынын тактыгын камсыз кылуу үчүн, реакция системасын музга даярдаңыз.

6. Бөлүнүү реакциясынын убактысы так болушу керек. Бөлүнүү кадамынын реакция убактысы фрагмент продуктуларынын өлчөмүнө түздөн -түз таасирин тийгизет, ошону менен китепкананын ДНК фрагменттеринин өлчөмү боюнча бөлүштүрүүгө таасир этет.

1. Бул комплектке кандай үлгү колдонулат?

Бул комплектин колдонулуучу үлгүсү жалпы РНК же жакшы РНК бүтүндүгү менен тазаланган mRNA болушу мүмкүн. Эгерде жалпы РНК китепкананы куруу үчүн колдонулса, адегенде рРНКны жок кылуу үчүн rRNAдин жок болуу топтомун (Cat#4992363/4992364/4992391) колдонуу сунушталат.

2. FFPE үлгүлөрү бул комплект менен китепкана куруу үчүн колдонулушу мүмкүнбү?

FFPE үлгүлөрүндөгү mRNA белгилүү бир деңгээлде начарлайт, салыштырмалуу начар бүтүндүк менен. Китепкананын курулушуна бул комплектти колдонууда фрагментация убактысын оптималдаштыруу сунушталат (фрагментация убактысын кыскартуу же фрагментацияны аткарбоо).

3. Продукциянын колдонмосунда берилген өлчөм тандоо кадамын колдонуп, киргизилген сегмент кичине четтөөнү пайда кылышы мүмкүн?

Өлчөмдү тандоо бул продукттун колдонмосундагы өлчөм тандоо кадамына так ылайык жүргүзүлүүгө тийиш. Эгерде четтөө болсо, анда магниттик мончоктор бөлмө температурасына тең салмактуу эмес же толук аралашпаган, пипетка так эмес же суюктук учунда калган болушу мүмкүн. Эксперимент үчүн адсорбциясы төмөн болгон кеңештерди колдонуу сунушталат.

4. Китепкана курулушунда адаптерлерди тандоо

Китепкананын курулуш комплектинде адаптер реагенти жок жана бул комплектти TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) менен бирге колдонуу сунушталат (4992641/4992642/4992378).

5. Китепкананын сапаты

Китепкананын сандык аныктамасы: Qubit жана qPCR китепкананын массалык концентрациясын жана молярдык концентрациясын аныктоо үчүн колдонулат. Операция продукциянын колдонмосуна ылайык катуу жүргүзүлөт. Китепкананын концентрациясы жалпысынан NGS ырааттуулугунун талаптарына жооп берет. Китепкананын таралыш диапазонун аныктоо: Agilent 2100 Bioanalyzer менен китепкананын таралыш диапазонун аныктоо.

6. Күчөтүү циклинин номерин тандоо

Көрсөтмөлөргө ылайык, ПТР циклдеринин саны 6-12, жана керектүү ПТР циклдеринин саны үлгү киргизүүгө ылайык тандалышы керек. Жогорку кирешелүү китепканаларда, адатта, ар кандай даражада күчөтүлөт, бул Agilent 2100 Bioanalyzerди аныктоодо максаттуу диапазондун чокусунан кийин бир аз чоңураак чоку менен көрүнөт, же Qubitтин концентрациясы qPCRге караганда төмөн. Жеңилдетүү - бул кадимки көрүнүш, ал китепкананын ырааттуулугуна жана кийинки маалымат анализине таасир этпейт.

7. Spikes Agilent 2100 Bioanalyzerдин аныктоо профилинде пайда болот

Agilent 2100 Bioanalyzer аныктоодо чукулдардын пайда болушу үлгүлөрдүн бирдей эмес бөлүнүшүнөн улам болот, мында белгилүү бир өлчөмдө фрагменттер көп болот жана бул ПТР байытуудан кийин айкыныраак болуп калат. Бул учурда, өлчөм тандоону аткарбоо сунушталат, башкача айтканда, фрагментация шартын 94 ° Ске 15 мүнөт инкубациялоо үчүн коюңуз, мында фрагменттин таралышы аз жана концентрацияланган, жана бир тектүүлүгүн жакшыртууга болот.